将稀释过后的细胞悬液用以计算原始溶液当中的细胞数量，这属于实验室里面一项基础然而关键的定量技术，其得出的结果直接关联到下游实验的成功或者失败。

装片制备前的细胞处理

在进行细胞计数之前，务必要绝对保证细胞于溶液当中分布得均匀。刚从培养箱取出来的细胞悬液常常是存有聚集现象的，倘若直接去计数就会致使结果严重地偏低。这就需要借助移液器反复地吹打，或者运用涡旋振荡器来进行短时间的混合，以此来打散细胞团块。

准确计数的前提是细胞悬液均匀，要是细胞成团，在计数板上分布就会不均匀，不管计数哪个区域，得到的数值都不具代表性，反映不出真实的细胞浓度，最终致使后续实验的细胞接种量出现错误。

确定合适的稀释倍数

稀释倍数的挑选取决于细胞原本浓度，对于生长得密集的细胞，一般得用新鲜的培养液于无菌离心管里开展稀释，比如说开展10倍或者20倍的稀释，目的是让最终滴加至计数板上的悬液，在显微镜下每个计数格内的细胞数量在20及50个之间。

此范围是鉴于统计学的考量，数量过少，随机误差便会增大，数量过多，细胞易于重叠，难以分辨，借助预实验估算浓度，接着进行正式稀释，是确保计数效率以及准确性的关键步骤，可避免因细胞过密而致使无法计数的尴尬境地。

血球计数板的使用要点

血球计数板乃用以细胞计数的标准工具，其关键结构为中央带有精密网格的计数室，加样之前需借助擦镜纸将计数板以及盖玻片予以彻底清洁，盖玻片务必要紧紧覆盖于计数板两侧的支撑脊之上，借此利用虹吸原理形成固定的计数空间。

取加样时，借助微量移液器，汲取出，约为10微升的，混匀过后的，稀释之后的细胞悬液，自计数板边缘处的V形槽，缓缓地进行注入，以使液体自行去充盈计数室。要防止产生气泡或者液体溢出至两侧的槽内，不然的话，便会造成计数室的容积被改变，进而引入误差。

显微镜下的计数规则

于低倍镜之下寻找到计数网格后，所需转为高倍镜来开展实际计数，一般计数四个角落的大方格以及中央的一个大方格，合起来是五个大方格以内的细胞总的数量，针对压在方格左侧以及上方边线上的细胞，依照“计上不计下，计左不计右”的准则 。

进行计数之际，要明晰分辨有生命的细胞同已死亡的细胞，这是必须的。一旦开展了台盼蓝染色这项操作，呈现无色状态的有生命的细胞跟显现蓝色的已死亡的细胞之间的对比是颇为显著的。要是没有实施染色，那就得凭借细胞的形态以及折光性来做出判断，有生命的细胞其轮廓清晰且透亮，已死亡的细胞通常会变得黯淡并且出现皱缩的情形。而这个步骤是需要具备耐心以及保持一致的判断标准的。

细胞浓度的计算过程

计数完成之后，把五个大方格的细胞总数代入公式来进行计算。公式是这样的：细胞浓度为每毫升含有的细胞个数，等于五个大方格细胞总数除以5，再乘以稀释倍数，然后乘以10到4次幂。这里除以5的目的是得到每个大方格的平均细胞个数，乘以10到4次幂是为了把计数室的容积合算成为每毫升的系数。

像比如说，要是针对原液做了5倍的稀释这一操作，然后去计数五个大方格从而得到总细胞数是200个，那么原液细胞浓度就是(200/5)×5×10^4等于2.0×10^6个/毫升。而这样所得的这个结果能够被用于后续为计算所需要接种体积或者去开展细胞活率分析 。

计数误差的常见来源

众多因素于操作进程之中将会引入误差，使得误差产生，导致计数结果出现偏差。细胞悬液混合不均匀这种状况乃是最大的误差源头所在之处，能够致使前后两次计数得出的结果存在极大差异，差异程度显著。加样的时候产生了气泡、计数的空间填充有不完全或者过量的情况，会直接对计数这一行为所包含的体积造成改变，进而造成系统性的偏差，使其出现偏差 。

另一主要误差是主观判断差异，不同操作者执行边缘细胞的计数规则不一致，对细胞团、碎片与单细胞的判断不同，这都会影响结果，因重要实验常要求同一人多次计数取平均值，或由多人独立计数核对。

当你开展细胞计数工作之际，所碰到的最难予以判断的情形，究竟是细胞存在轻微重叠的状况呢，还是细胞形态并不典型从而难以跟杂质区分开来呢？欢迎于评论区去分享你自身的经验以及技巧哟，要是觉得本文具备一定帮助的话，那就请点赞予以支持呀。